Indentification of circular ribonucleic acids differentially expressed in apoptotic HeLa cells

Abstract

Apoptosis is a mechanism of programmed cell death that is essential for survival, homeostatis and development. Various protein coding genes and non-coding RNAs were reported as apoptosis regulators. However, the potential roles of circular RNA in the regulation of apoptosis are still unknown. In this study, we have performed transcriptomics study to reveal differentially expressed, pathway-drug specific and/or global circRNAs in apoptotic HeLa cells. Cisplatin (CP), doxorubicin (DOX), Fas mAb(FAS) and TNF-alpha (TNF-a) were used to trigger apoptosis in HeLa cells. Apoptosis rates of three replicates of treatment and control cells were measured by flow cytometry and differentially expressed circular RNAs were identified by deep RNA sequencing. Circular RNA candidates were firstly sorted based on their significance according to pad j value, further classified based on fold change, pathway-drug specificity and source genes. Then, circular RNA candidates were analysed bioinformatically to obtain their coding potential, potential miRNA binding sites and involvement in possible apoptotic pathways. Furthermore, divergent primers were designed to validate backsplicing junction sequence of circular RNA candidates. RNAse R treatment was used to eliminate linear transcripts and enrich circular RNAs. The expression of candidate circular RNAs was analysed RNAse R treated samples. Backsplicing junctions of positive circular control circ-HIPK3 was validated by TA cloning and sequencing. Differential expression of positive control (circ-HIPK3), candidate-8 and candidate-6 were validated by quantitative PCR.

Apoptoz, hayatta kalma, dengeleşim ve gelişim için gerekli olan programlanmış hücre ölümü mekanizmasıdır. Çeşitli protein kodlayan genler ve kodlayıcı olmayan RNA'lar apoptoz regülatörleri olarak rapor edilmiştir. Bununla birlikte, apoptozis regülasyonunda halkasal RNA'nın potansiyel rolleri hala bilinmemektedir. Bu çalışmada,apoptotik HeLa hücrelerinde farklı şekilde ifade edilen, yolak-ilaç spesifik ve / veya global halkasal RNA'ları ortaya çıkarmak için transkriptomik çalışma gerçekleştirdik. HeLa hücrelerinde apoptozu tetiklemek için sisplatin, doksorubisin, Fas mAb ve TNFalfa kullanılmıştır. İlaçla muamele edilmiş hücreler ve kontrol hücrelerinin üç tekrarının apoptoz oranı akış sitometrisi ile ölçülmüş, farklı şekilde ifade edilen halkasal RNA'lar derin RNA dizilemesi ile tanımlanmıştır. Farklı olarak ifade edilen halkasal RNA adayları, ilk olarak padj değeri baz alınarak anlamlılıklarına göre sıralanmış daha sonra kat değişimi, yolak-ilaç spesifisitesine ve kaynak aldıkları genlere dayalı olarak sınıflandırılmıştır. Daha sonra, halkasal RNA adayları, onların kodlama potansiyellerini, potansiyel mikro RNA bağlama bölgelerini ve olası apoptotik yolaklara katılımlarını elde etmek için biyoinformatik olarak analiz edilmiştir. Ayrıca ıraksak primerler halkasal RNA adaylarının geri birleşme bağlantı dizisini doğrulamak için tasarlanmıştır. Lineer transkriptleri ortadan kaldırmak ve halkasal RNA'ları zenginleştirmek için RNAse R uygulaması yapılmıştır. Halkasal RNA adaylarının ifadesi RNAse R ile muamele edilmiş örnekte analiz edilmiştir. Halkasal pozitif kontrolün geri birleşme bağlantı dizisi TA klonlama ve dizileme ile doğrulanmıştır. Pozitif kontrol (circ-HIPK3), aday-8 ve aday-6 nın farklı ifadesi kantitatif PCR ile doğrulanmıştır.