The Rational Design of a Novel Biocatalyst Using the Heme-Nitric Oxide/Oxygen Binding Protein

Abstract

Recent advances in recombinant DNA technology and protein design have led to the application of biocatalysis as an alternative to chemical catalysis in the synthesis of enantiopure products due to high regio- and enantioselectivity. Hemeproteins are proteins with a heme prosthetic group that play diverse roles in biological systems, making them good candidates for biocatalysis. The Heme-nitric oxide/oxygen binding (H-NOX) protein was identified by homology to the soluble guanylate cyclases. Here, the H-NOX domain from the methyl-accepting chemotaxis protein, Thermoanaerobacter tencogenesis (TtH-NOX), was tuned into a biocatalyst using rational design. Four variants of TtH-NOX were cloned, purified and characterized. Each variant was then tested for their catalase and peroxidase activities. The wild type TtH-NOX inefficiently catalyzed the hydrogen peroxide decomposition (catalase activity) and 2,2’-azino-bis(3- ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) oxidation (peroxidase activity). However, the Y140H mutant exhibited an efficient five-fold increase in catalase and peroxidase activities as compared to the wild type. The other mutants, H102Y, H102C and Y140A TtH-NOX, were not good catalysts for both reactions. Therefore, the mutations resulted in changes in reaction rates and electronic properties of the heme group. The mutations affected the molecular mechanism of the hemeprotein, showing that both the proximal and distal pocket residues are vital for catalysis. However, the mutation of the distal tyrosine to histidine of TtH-NOX has significantly improved its catalytic activities. These observations contribute to the understanding of the physiological roles of hemeproteins. This project could also lead to discovery of novel biocatalysts and aid in the design of future biocatalysts.

Rekombinant DNA teknolojileri ve protein tasarımındaki son gelişmeler, biyokatalizörlerin ilaç ve zirai kimyasalların üretiminde kimyasal katalizörlere alternatif olarak kullanılmasına olanak tanıdı. Biyokatalizörler özellikle enzimlerde gözlenen yüksek regio- ve enantio seçimliliklerinden dolayı saf ürünlerin sentezlenmesinde kullanılmaktadır. Biyokatalizörler ayrıca çevre dostudur. Hemoproteinler hem prostetik grubunu içerirler ve biyolojik sistemlerde çeşitli roller üstlenenilir ve biyokatalizör olabilirler. Hem-Nitrik Oksit/Oksijen bağlanan (H-NOK) proteinler nitrik oksit (NO) algılayıcı çözünür guanilat siklaz (sGC) proteini ile homoloji göstermeleriyle kesfedilmişlerdir. Bu projede Thermoanaerobacter tencogenesis (TtH-NOK)’in metilakseptör kemotaksi proteininin H-NOK bölgesi, rasyonel tasarım kullanılarak modifiye edildi. Dört TtH-NOXKvaryantını klonlandı, eksprese edildi, saflaştırıldı ve mutasyonların proteinin spektroskopik ve katalitik özellikleri üzerindeki etkileri incelendi. Her bir varyant daha sonra hidrojen peroksidin (H2O2) bozunması ve 2, 2’- azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sülfonk asit) (ABTS)’in oksidasyonu gibi tepkimeler ile test edildi. Doğal TtH-NOK H2O2 bozunmasını ve ABTS oksidasyonunu düşük verim ile kataliz etti. Bununla birlikte Y140H mutant en verimli peroksidaz ve oksidaz aktivitelerini gösterdi. Y140H distal mutantı doğal enzimle karşılaştırıldığında katalizde beş kat artış sergiledi. Diğer mutantlar; H102Y, H102C ve Y140A TtH-NOK ilgili reaksiyonlar için iyi katalizörler değillerdi. Bu yüzden, mutasyonlar reaksiyon hızlarında ve hem kofaktörünün elektronik özelliklerinde değişim gösterdiler. Mutasyonlar ayrıca heme proteininin moleküler mekanizmasını etkilediler. Bu sonuçlar proksimal ve distal cepteki amino asitlerin kataliz için önemli olduğunu gösterdi. Bununla birlikte distal tyrosinin histidine mutasyonu enzimin katalitik aktivitesini önemli ölçüde arttırdı. Bu gözlemler hemoproteinlerin fizyolojik rollerini anlamaya katkıda bulunacaktır. Bu proje yeni biyokatalizlerin keşfine ve gelecekte yeni biyokatalizörlerin tasarlanmasına yardım edecektir.