Cloning, Heterologous Expression and Purification of Various Wax Ester Synthases in Escherichia Coli

Abstract

Biodiesel, known all around theWorld, is a diesel fuel containing fatty acid methyl esters (FAMEs) and fatty acid ethyl esters (FAEEs) with different molecular weights. The recent studies which are about the development of FAEE focused on production of FAEEs in vivo syntheses. This synthesis is catalyzed by wax ester synthases (WS). Bifunctional wax ester synthase/acyl-coenzyme-A (acyl-CoA): diacylglycerol acyltransferase (WS/DGAT) synthesizes wax ester by processing a certain range of fatty alcohols and fatty acyl-CoAs. It is considered as the final enzyme in biosynthetic process of wax ester production. Aim of the research is cloning, heterologous expression, purification and crystallization trial of was ester synthases from M. aquaeolei VT8 (MaWES) and R. opacus PD630 (RoWES). MaWES was cloned into pET expression vector and heterologous expression of MaWES was carried out in E.coli BL21 (DE3) strain. Three chromatography systems were used for purification of MaWES. After Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC), buffer exchange and gel filtration chromatography, enzyme was purified with approximately 100 mg yield. This project can pave the way for structural studies WS/DGAT enzymes mentioned above. In summary, the findings of this study will circuitously help for solving the relationship between function and structure of these enzymes. It may lead to increased generation of FAEE based biodiesel.

Son yüz yılda yakıt tüketiminin tüm dünya üzerinde artması ve fosil yakıtların çevreye verdikleri zarar ve yakın süreç içerisinde tükenecek olma kaygısı alternatif yakıt kaynakların oluşturulma çabasını arttırmıştır. Alternatif yakıt kaynaklarından olan biyodizel, sahip olduğu avantajlarla fosil yakıtlara alternatif olma özellğgine sahiptir. Biyodizel üretimi mevcut sistemlerde metanolün ve biyolojik yağların transesterifikasyon reaksiyonu sonucu gerçekleştirilmektedir. Son dönem de yapılan çalışmalar, biyodizel yakıtının üretiminde etanol kullanımının biyolojik organizmalar aracılığıyla gerçekleştirmesi üzerine odaklanmış bulunmaktadır. Mum esteri sentaz enzimi (WS/DGAT) yakın tarih içerisinde keşfedilmiş olup farklı mikroorganizmalar da yapılan çalışmalar ile mum esteri sentaz enzimi aracılığı ile pilot ölçekte yağ asidi etil ester (mikrodizel) üretimi gerçekleştirilmiştir. Fakat geniş substrat seçiciliği özelliğine sahip olan WS/DGAT enzimlerinin substrat olarak uzun zincirli yağlı alkolleri ve yağ asitlerini tercih etmesi etanol gibi kısa zincire sahip olan alkollerin büyük ölçüde dışarılanmasına sebep olmaktadır. Bu çalışma da amaç, M. aquaeolei VT8 ve R. opacus PD630 kaynaklı farklı iki mum esteri sentaz enziminin klonlanması, heterolog ekspresyonu, saflaştırılması ve saflaştırılmış olan WS/DGAT’ler ile kristalizasyon denemesi amaçlanmaktadır. M. aquaeolei VT8 kaynaklı mum esteri sentaz enzimi pET22bTV vektörü içerisine klonlanmış ve E.coli BL21 (DE3) hücre hattı kullanılarak heterolog ekspresyon ile üretilmiştir. İmobilize metal afinite kromatagrafi ve jel filtrasyon kromatografi yöntemleri kullanılarak MaWES proteini saflaştırılmıştır. Bu çalışma; gelecek için önem arz eden biyodizel üretimi için kullanılacak olan WS/DGAT enziminin klonlanma ve saflaştırma aşamalarına ışık tutarak, gelecekte yapılması muhtemel protein mühendisliği çalışmalarına dolaylı olarak yardımcı olacaktır.