Hydrogels and Self-Assemled Nanostructures Based on Wool Keratose

Abstract

In this study, water soluble keratose proteins were extracted from “Ovis aries” wool using peracetic acid oxidation with a yield of 35 ± 5 %. Wool samples and the extracted keratose proteins were characterized by using FT-IR, XRD, SEM and TGA techniques. α-keratose fractions (MW = 43-53 kDa) along with cleaved fragments of α-keratoses with molecular weights between 23 and 33 kDa were identified in the extracted protein mixture using SDS-PAGE analysis. DLS and AFM experiments indicated self-assembled globular nanoparticles with diameters of 20-40 nm formed at 5 and 10 mg/ml keratose concentrations. On the other hand, at 10 % w/v keratose concentration interconnected keratose hydrogels with pore sizes of 6 ± 4 and 7 ± 4 μm were obtained upon incubation at 37 and 50 °C, respectively. Storage moduli (G’) of these physical hydrogels were increased from ~100 to ~1000 Pa, as gelation temperature was increased from 37 to 50 °C. Hydrogels were also obtained at 7.5 % w/v keratose concentration by the addition of a crosslinker, THPC. Amine group:crosslinker ratio was used as 1:1, 1:2 and 1:4. As the amount of crosslinker increased, network transformed from fibrous to more planar structures exhibiting a significant decrease in average pore size from 24 to 11 μm. G’ values of the crosslinked hydrogels were obtained between ~1 and ~5 kPa tuned by the crosslinking amount. Cell interaction properties of a select physical hydrogel prepared at 37 °C was tested using CCK-8 assay. It was observed that the keratose hydrogel supported L929 mouse fibroblast cell proliferation as much as collagen, which suggests that these keratose hydrogels can be promising candidates in soft tissue engineering applications.

Bu çalışmada, keratoz proteinleri, “Ovis aries” adı verilen evcil koyun türünün yününden, perasetik asit oksidasyonu kullanılarak yaklaşık 35% verim ile çıkartılmıştır. Yünler ve elde edilen keratoz proteinleri, FT-IR, XRD, SEM ve TGA teknikleri ile karakterize edilmiştir. SDS-PAGE analizi ile bu protein karışımının 43-53 kDa molekül ağırlığına sahip olan α-keratoz proteinlerinden ve 23-33 kDa aralığında bu proteinlerin parçalarından oluştuğu saptanmıştır. DLS ve AFM testleri, 5 ve 10 mg/ml derişime sahip keratoz çözeltilerinin 20-40 nm hidrodinamik çapa sahip küresel nanotaneciklere kendiliğinden düzenlendiğini göstermiştir. Öte yandan, keratoz konsantrasyonu 100 mg/ml seviyesine çıkarıldığında ve sırasıyla 37 ve 50 °C sıcaklıklar altında inkübe edildiğinde, ortalama gözenek boyutları sırasıyla 6 ± 4 and 7 ± 4 μm olan hidrojel ağlarının elde edildiği görülmüştür. Bu fiziksel hidrojellerin inkübasyon sıcaklıklarının 37 °C’den 50 °C ye çıkarılmasıyla, saklanan modül (G’) değerinin 100 Pa’dan 1000 Pa değerine çıktığı gözlemlenmiştir. Hidrojeller ayrıca kütlece % 7.5 keratoz konsantrasyonuna sahip olan protein çözeltilerine THPC kimyasal çapraz bağlama ajanları eklenerek de oluşturulmuştur. 1:1, 1:2 ve 1:4 amin grubu:çapraz bağlayıcı oranlarında 3 farklı tipte kimyasal hidrojel hazırlanmıştır. Bu oran arttıkça, jel ağının iğsi yapıdan düzlemsel yapıya doğru değiştiği ve ortalama gözenek çapının 24 μm’den 11 μm’ye düştüğü gözlemlenmiştir. 1 kPa ve 5 kPa arasında elde edilen G’ değerlerinin THPC miktarının değişimi ile kontrol edilebildiği saptanmıştır. 37 °C’de hazırlanmış seçilmiş fiziksel hidrojelin hücre etkileşim özellikleri CCK-8 yöntemi ile test edilmiştir. Bu hidrojelin L929 fare fibroblast hücrelerinin büyümesini kollajen kadar desteklediği görülmüş ve keratoz bazlı hidrojellerin yumuşak doku mühendisliğinde gelecek vaat eden adaylar olabileceği öngörülmüştür.