Purification and Biochemical Characterization of Xylanase Expressed in Thermophilic Geobacillus Sp.

Abstract

Xylanase is an enzyme that catalyzes the degradation of the linear polysaccharide β-1,4-xylan into xylose and breaks down the hemicellulose structure of plant cell wall. The xylanolytic property of the enzyme makes it preferable for many biotechnological applications in industry. This enzyme is possibly produced by some bacterial and fungal microorganisms. In this study, briefly, xylanase enzyme was expressed in thermophillic Geobacillus sp. and purified by cold acetone precipitation and gel filtration chromatography. Molecular weight of our xylanase was found as 40.1 kDa by SDS-PAGE and this protein band was verified by Native-PAGE activity staining. Finally, it was characterized using biochemical methods. For characterization studies, Km and Vmax values were calculated from Lineweaver-Burk plot as 10.2 mg/ml and 31.7 U/ml, respectively. The optima temperature and pH for enzyme activity were investigated using beechwood xylan as substrate and found as 55°C and 8.0, respectively. Furthermore, effects of some metal ions, various chemical reagents and organic solvents on enzyme activity were also determined and we observed that Ca2+, Mn2+ and Co2+ affected the activity positively while Zn2+, Cd2+, Fe3+, EDTA, SDS, CHAPS and DTT shielded the activity. And only β-mercaptoethanol caused a significant change amoung organic solvents. Lastly, that the enzyme has a long shelf-life was confirmed assaying the samples taken from enzyme stocks stored at +4°C and room temperature for six weeks.

Ksilanaz, β-1,4-ksilan düz zincirli polisakkaritini ksiloza parçalayan ve bitki hücresi çeperinde bulunan hemiselüloz yapısını yıkan bir enzimdir. Ksilanaz, ksilan sindirme özelliği sayesinde sanayinin pek çok biyoteknolojik uygulama alanında tercih edilmektedir. Enzimi bakteriyel ve fungal çalışmalarla üretmek mümkündür. Çalışmamızı kısaca anlatmak gerekirse; ksilanaz enzimi thermophillic Geobacillus sp.’den üretilerek, soğuk aseton çöktürmesi ve ardından jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırılmış ve SDS-PAGE yöntemi ile moleküler ağırlığı 40.1 kDa bulunmuştur. Bu protein bandının bizim enzimimize ait olduğu ise Native-PAGE’ten sonra aktivite boyaması yapılarak tasdiklenmiştir. Son olarak, biyokimyasal yöntemlerle protein çalışmaları yapılarak karakterize edilmiştir. Karakterizasyon işlemleri sırasında, kayın kerestesi ksilanı substrat olarak kullanılmıştır. Km ve Vmax değerleri Lineweaver-Burk grafiğinden sırasıyla 10.2 mg/ml ve 31.7 U/ml olarak hesaplanmıştır. Enzim aktivitesi için optimum sıcaklık ve pH sırasıyla 55°C ve 8.0 olarak saptanmış, enzim stabilitesinin geniş sıcaklık ve pH aralıklıklarında 2 saate kadar sürdüğü görülmüştür. Ayrıca, bazı metal iyonlarının, çeşitli kimyasal maddelerin ve organik çözücülerin aktiviteye etkisi de araştırılmış, Ca2+, Mn2+ ve Co2+ ’ ın aktiviteyi olumlu yönde etkilediği, Zn2+, Cd2+, Fe3+, EDTA, SDS, DTT ve CHAPS’ ın aktiviteyi engellediği, organik çözücüler arasında ise sadece β-merkaptoetanolün kayda değer bir değişime sebep olduğu gözlemlenmiştir. Son olarak, enzimin raf ömrünün uzun olduğu da altı hafta boyunca +4°C’de ve oda sıcaklığında duran enzim stoklarından haftada bir alınan örneklerle test edilip onaylanmıştır.