Identification and detection of cis-platin binding proteins by laser induced breakdown spectroscopy

Abstract

In this study, an all-optically designed laser plasma spectroscopic technique for rapid identification and detection of cisplatin-binding proteins on electrophoretic gel spots prior to molecular mass spectrometric analysis is demonstrated. For this purpose, human serum albumin, human apo transferrin and horse heart myoglobin standard proteins and protein extracts from HeLa cancer cells were subjected to; incubation with cis-platin solution for several hours. Then, non-reducing polyacrylamide gel electrophoretic separation was applied. Followed by the visualization of proteins in the gel by Coomassie Brilliant Blue staining technique protein spots on the gel were dried between two cellophane sheets and subjected to laser ablation by highly energetic laser pulses. In addition, prior to nr-SDS-PAGE separation cis-platin binding to standard proteins were monitored by ESI-MS with several measurements made in 24 hours of incubation time. Using a Nd:YAG laser at its second harmonic wavelength, 532nm, 10 Hz frequency and 10 ns pulse duration, a micro-plasma was created on dried gel spots. Resulting plasma emission light was collected with collection lenses and transferred to a spectrograph via fiber optic cable. An intensified charge coupled device (ICCD) detector enabled multielemental analysis of platinum binding protein samples. Platinum binding proteins were recognized from the prominent neutral emission line, Pt (I) at 273.3 nm, in a plasma formed by the focused laser pulses on the gel, just in the center or in the vicinity of the electrophoretic spot. Spectral emission intensity of Pt lines from LIBS data has been optimized with respect to laser energy and detector timing parameters. Optimization of LIBS experimental parameters have been studied on polyacrylamide gels soaked in cis-Pt solution for Pt signal. It has been shown that, LIBS is a suitable method for identifying Pt in proteins, in gel medium, with nanogram levels of detection capability. The technique was applied to HeLa (human cervical cancer cells) cells extract for the detection of Pt-binded HSA after standard addition of known amounts of protein.

Bu çalışmada, sisplatin bağlı proteinlerin kütle spektrometresi ile analizi öncesinde jel içinde hızlı bir şekilde belirlenmesi ve tayini için tamamen optik tasarıma dayalı bir lazer plazma spektroskopi tekniği gösterilmektedir. Bu amaç için, insan serum albümini, insan apo transferini ve at kalbi miyoglobini standart proteinleri ve HeLa kanser hücrelerinden elde edilmiş protein özütleri sis-platin çözeltisi ile birçok saat inkübe edilmiştir. Daha sonra, indirgeyici olmayan poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrılması uygulanmıştır. Proteinler jel içinde Coomassie Brilliant Blue ile görselleştirilmelerinin ardından iki selofan tabakası arasında kurutulup, yüksek enerjili lazer darbeleri ile lazer ablasyonuna tabi tutulmuştur. Buna ek olarak, nr-SDS-PAGE ayırması öncesinde, standart proteinlerin sis-platine bağlanması 24 saat inkübasyon süresinde ESI-MS ile yapılan pek çok ölçüm ile izlenmiştir. 532 nm dalga boyunda, 10 Hz frekansda ışıma yapan ve 10 ns darbe süreli bir Nd:YAG lazer kaynağı ikinci harmonik dalga boyunda kullanılarak kurutulmuş jel bölgeleri üzerinde mikro plazma oluşturmak için kullanılmıştır. Plazmadan saçılan ışınlar toplama lensleri ile toplanıp fiber optik kablo yardımı ile bir spektrografa transfer edilmiştir. Şiddetlendirilmiş bir CCD detektör sis-platin bağlı proteinleri çoklu element analizini mümkün kılınmıştır. Platin bağlı proteinler üzerinde elektroforetik noktanının merkezine veya yakınına odaklanan lazer pulsu ile oluşan plazmada açığa çıkan 273.3 nm deki platinin atomik emisyon çizgisi ile tanınırlar. LIBS datasından elde edilen platininin atomik emisyon çizgilerinin yoğunluğu lazer enerjisi ve detektör zamanlama parametrelerine göre optimize edilmiştir. LIBS’in deneysel parametreleri sis-platin çözeltisinin içine batırılmış polyakrilamid jel üzerinde platin sinyali için çalışılmıştır. LIBS’in jel ortamındaki proteinlerin platin içeriğini nanogram algılama yeteneği kapasitesiyle ile araştırmak için uygun bir yöntem olduğu gösterilmiştir. Teknik HeLa kanser hücreleri ekstraklarındaki platin bağlı HSA’nın bilinen miktarlarda standart ilave edildikten sonraki tayini için kullanılmıştır.