Chacterization of drug resistance mechanisms against antifungal agent Voriconazole

Abstract

The rapid progress in medicine provides an increase in both average life span but also increases number of patients who need intensive care throughout the world. The morbidity and mortality of systemic fungal infections have become a serious problem because of suppressed immunity due to chemotherapy or intentional use of suppressants after tissue/organ transplantations. Voriconazole (Vfend, Pfizer) is one of antifungal agent against these fungal infections as a derivative of fluconazole. However some fungi types gain resistance against this agent. In this project, we use budding yeast Saccharomyces cerevisiae as a model organism to identify the genes that cause resistance Voriconazole by performing a genome wide screening. MRS3 and TRI1 genes were determined as resistant genes against lethal dose of Voriconazole. Their overexpression exhibited resistance to Voriconazole and also Ketoconazole in cross-resistance test. According to real-time PCR results, both MRS3 and TRI genes showed overexpression in IC50 of Voriconazole treatment when compare with their untreated status. Microaaray analysis indicated the expression change of our resistant genes is not more than 2 fold. In addition to expression analysis, functional analysis such as membrane dynamics tests have salt (NaCl, LiCl) and cationic drug (HygB,spermine,TMA) tolerance, membrane potential, volume/size measurements and cytoplasmic pH values were analyzed to reveal the mechanisms of resistance. Our results showed that no linkage between Variconozole resistance provided by MSR3 and TRI1 genes and functional analyses mentioned above.

Kemoterapi gibi bağışıklık sisteminin değişik nedenlerle zayıflamasına ya da transplantasyonlar sonrasında doku reddine neden olabilen tepkisini azaltmak amacıyla bilerek zayıflatılmasına bağlı olarak gelişen sistemik mantar enfeksiyonlarının morbidite ve mortalitesi de önemli ölçüde artmaktadır. Vorikonazol, sistemik mantar enfeksiyonlarına karşı kullanılan bir tür mantar ilacıdır. Fakat birçok mantar türü bu tarz ilaçlara direnç kazandığı gibi Vorikonazole karşı dirençli mantar türleri de mevcuttur. Mantar ilaçlarına karşı gelişen dirençlilik mekanizmalarının aydınlatılması bu olumsuz gelişmenin önünü kesecek, yeni tedavi kombinasyonlarının uygulanabilmesinin yanı sıra yeni ilaçların geliştirilmesine katkıda bulunacaktır. Bu çalışmada Saccharomyces cerevisiae model organizması kullanılarak, BY4741 yabani tip maya suşu içerinde dirençlilik çalışmaları yapılmıştır. Genom düzeyinde yapılan taramalar sonucu bulunan MRS3 ve TRI1 genlerinin fazla ifadelenmesi, öldürücü doz ve daha yüksek dozlarda Vorikonazole karşı dirençlilik göstermiştir. Bu iki gen de çapraz dirençlilik testlerinde aynı azol grubunda bulunan Ketokonazole karşı dirençlilik göstermiştir. Bu genlerin öldürücü dozun yarısı kadar Vorikonazole muamelesinin ardından, eş-zamanlı PCR analizine göre ekspresyonunun ilaç uygulanmamış durumlarına göre fazla olduğu gözlemlenmiştir. Tüm genom mikroarray analizinde ise genlerin ifadelemesinin iki kat değişiklikten az olmasından ötürü, MRS3 ve TRI1 genlerine rastlanmamıştır. Fonksiyonel analiz olarak membran dinamikleri test çalışmaları yapılmıştır. Dirençli genlerin ve mutantlarının tuz ve katyonik ajanlar varlığında tepkisi test edilmiştir. Sonuçlara gore tuz ve katyonik ajanlara karşı gelişen dirençlilik mekanizmasının, Vorikonazole dirençlilik mekanizmasıyla alakası olmadığı anlaşılmıştır. Membran potansiyeli ve hücre büyüklüğü/hacmi ölçümlerinde de genin aşırı ifadelendiği hücrelerde ve mutant hücrelerinde farklı bir sonuca rastlanmamıştır. Ek olarak sitoplazmik pH ölçümünde de pHuolin plasmidi içeren mutant hücrelerin yabani tip maya suşuna gore pH değişimlerinin olmadığı gözlemlenmiştir