Üçlü Negatif Meme Kanseri Hücrelerinde M1a ve M6a Rna Metilasyonlarının Araştırılması

Abstract

Meme kanseri dünya çapında kadınlarda en sık görülen kanser türüdür ve iki alt gruba ayrılır: invaziv lobuler ve invaziv duktal meme kanseri. Bunlardan invaziv duktal meme kanseri, %80 oranında dünya çapındaki meme kanserleri arasında yerini almaktadır. Üçlü negatif meme kanseri ise östrojen reseptörü, progesteron reseptörü ve insan epidermal büyüme faktörü reseptör 2'nin çoğaltılmasını gerçekleştiremeyen agresif bir meme kanseri alt türüdür. Kanser çalışmalarında RNA metilasyonları da hücrenin kaderine etkilerini kanıtlamış önde gelen modifikasyonlardır. Bütün metilasyonlarda olduğu gibi, m6A ve m1A de yazıcı, okuyucu ve silici proteinlerin yardımı ile gerçekleştirilen dinamik bir düzenleme mekanizmasına sahiptir. Bu proteinler, kanser türlerine göre farklı ifadelenme seviyelerine sahiptirler. Bu karakteristik özellikleri ile tedavi ve tespit amaçlı kullanılmaları hedeflenmektedir. Mevcut tez çalışmasında, yazıcı proteinleri olan METTL3 ve TRMT61A proteinlerinin susturulması sonrası, m6A ve m1A metilasyonlarının etkilerinin ve karşılaştırılmasının üçlü negatif meme kanseri hücrelerinden biri olan HCC1143 hücre hattında incelenmesi amaçlanmıştır. Öncelikle, METTL3 susturulması sonrası 72 saatte, maksimum düzey olan %41,2 oranında m6A miktarında azalma gözlenmiştir. Ardından fenotipik etkileri incelemek amaçlı gerçekleştirilen canlılık deneylerinde, METTL3 ve TRMT61A'nın susturulması ile sırasıyla %40,1 ve %27,4 azalma gözlemlendi. Ek olarak, TRMT61A'nın yıkılmasının aksine, yalnızca m6A metilasyonunun azalması sonucu G2/M fazında duraksama gözlenmiştir. m6A miktarının azaltılması sonucu 585 artan/azalan gen ve m1A metilasyonun azaltılması sonucu 687 artan/azalan gen tespit edilmiştir. Bunlardan 151 gen ortak olarak değişkenlik göstermiştir. Gen Ontolojisi zenginleştirme analizleri sonucunda METTL3 yıkımında hücre migrasyonu ve hücre motilite yolakları yoğun olarak gözlenmiştir. m1A azalması sonucu ise bağışıklık sistemi ve canlılığı negatif yönde etkileyen yolaklarda değişkenlik gözlenmiştir.

Breast cancer is the most common type of cancer in women worldwide and divided into two sub-groups: invasive lobular and invasive ductal carcinoma. Invasive ductal carcinoma accounts for 80% of breast cancers. Triple negative breast cancer (TNBC) is also an aggressive type of breast cancer that fail to amplify estrogen receptor, progesterone receptor and human epidermal growth factor receptor 2. Intercalarily, RNA methylations have proven their effects on cell fate, especially in cancer studies. m6A and m1A have dynamic regulation mechanisms catalyzed by writer, reader and eraser proteins. These proteins have different expression levels based on cancer types and intended to be used for therapeutic/diagnostic approaches. In the current thesis study, it was aimed to examine the effects and comparison of m6A and m1A methylations in TNBC cell line, HCC1143, after METTL3 or TRMT61A silencing. Firstly, the maximum level of reduction in methylation amounts was attained at 72-hour as 41.2% decrease in m6A amount. To examine the phenotypic effects of silencing, we performed viability experiments and observed 40.1% and 27.4% decrease by METTL3 and TRMT61A knock-down, respectively. Additionally, G2/M phase arrest was observed upon METTL3 silencing. RNA sequencing experiments were conducted to evaluate the effects of knock-down at the molecular level. 585 differentially expressed genes (DEGs) were detected after reduction in m6A and 687 DEGs after TRMT61A silencing. 151 DEGs were common. Based on GO analyses, cell migration pathways were intensely observed in METTL3 while variability was observed in the immune-related and negative regulation of proliferation pathways after TRMT61A knock-down.