Biochemical and functional characterization of circular RNAs differentially expressed in cisplatin-treated HeLa cells

Abstract

Circular RNAs (CircRNAs) are a novel class of single-stranded, covalently-closed RNA molecules. Functional investigations of the circRNAs provide insight into the mechanisms underlying gene regulation and cellular responses, which could ultimately lead to the development of new therapies for a wide range of diseases. In this thesis, four cisplatin (cis-diamminedichloroplatinum II, CP)-responsive circRNAs, circGALNT2, circBNC2, circBIRC6, and circCLASP1, were validated. The reverse genetics approaches, such as knockdown and overexpression strategies, showed that circCLASP1 is required for the proliferation of HeLa cells. The knockdown of circCLASP1 disrupts proliferation in HeLa, and its overexpression restores impaired proliferation. Further analyses revealed that circCLASP1 knockdown sensitizes HeLa cells against 20 μM and 40 μM cisplatin treatments. Interestingly, an IC50 dose of cisplatin causes Annexin V-/7AAD + cell death rather than apoptosis when combined with circCLASP1 knockdown. In light of these findings, five circRNA/miRNA/mRNA regulatory networks were constructed using computational approaches. Additionally, a transcriptomics analysis after circCLASP1 knockdown has supported all of these findings in that muscle cell proliferation genes were significantly altered upon circCLASP1 knockdown in HeLa cells. In conclusion, the findings suggest that the knockdown of circCLASP1 represses proliferation and sensitizes HeLa cells against cisplatin. CircCLASP1-knockdown mediated differential gene expression indicates proliferation, ROS response, iron metabolism, lipid peroxidation, and cell death. Further studies are needed to elucidate the precise mechanism of circCLASP1-mediated cell death and proliferation in muscle cells or liver cells and ROS-related diseases.

Halkasal RNA'lar (HlkRNA'lar) tek sarmallı, kovalent olarak kapalı RNA moleküllerinin yeni bir sınıfıdır. HlkRNA'ların fonksiyonel araştırmaları, geniş bir hastalık yelpazesi için yeni tedavilerin geliştirilmesine yol açabilecek olan, gen regülasyonu ve hücresel tepkilerin altında yatan mekanizmalar hakkında bilgi sağlar. Bu tezde, sisplatine yanıt veren dört hlkRNA, hlkGALNT2, hlkBNC2, hlkBIRC6 ve hlkCLASP1 doğrulanmıştır. Susturma ve aşırı ifade stratejileri gibi ters genetik yaklaşımları hlkCLASP1'in HeLa hücrelerinin çoğalması için gerekli olduğunu gösterdi. hlkCLASP1'in susturulması, HeLa'daki proliferasyonu baskılar ve aşırı ifadesi, baskılama etkisini ortadan kaldırır. Diğer analizler, hlkCLASP1 susturulmasının, HeLa hücrelerini 20 uM ve 40 uM sisplatin uygulamasına karşı duyarlı hale getirdiğini ortaya çıkardı. İlginç bir şekilde, bir IC50 dozunda sisplatin uygulaması, circCLASP1 susturulması ile birleştirildiğinde apoptoz yerine Annexin V-/7AAD + hücre ölümüne neden olur. Bu bulguların ışığında, hesaplamalı yaklaşımlar kullanılarak beş circRNA/miRNA/mRNA düzenleyici ağ inşa edildi. Ek olarak, hlkCLASP1 susturulmasını takiben yapılan transkriptomik analiz, kas hücresi proliferasyonu, apoptoz, lipid metabolizması, oksidatif stres tepkisi ve bağışıklık tepkisi genlerinin HeLa hücrelerinde hlkCLASP1 susturması sebebiyle önemli ölçüde değiştiğine dair tüm bu bulguları desteklemiştir. Sonuç olarak, bulgular hlkCLASP1'in susturulmasının proliferasyonu baskıladığını ve HeLa hücrelerini sisplatine karşı duyarlı hale getirdiğini göstermektedir. CircCLASP1 susturulması aracılı farklı gen ifadesi, proliferasyonu, ROS tepkisini, demir metabolizmasını, lipid peroksidasyonunu ve hücre ölümünü göstermiştir. Kas hücrelerinde veya karaciğer hücrelerinde ve ROS ile ilişkili hastalıklarda hlkCLASP1 aracılı hücre ölümü ve proliferasyonunun kesin mekanizmasını aydınlatmak için daha ileri çalışmalar gerekir.