Cloning and expression of the Pseudomonas sp KE38 extra-cullular protease gene in E.coli

Abstract

Proteases are enzymes that hydrolyze proteins into smaller pieces by breaking the peptide bonds. Protease enzyme is produced by all living things on Earth. Pseudomonas sp. KE-38 is a cold adapted bacterium isolated from soil at high altitude in Erciyes mountain, Kayseri. The purpose of this thesis was to clone the cold-active extracellular protease gene from Pseudomonas sp. KE-38, partial purification and characterization of the extracellular protease enzyme. The partial sequence of protease gene from Pseudomonas sp. KE-38 was analysed. The estimated size encoded by this gene after sequence analysis was 105 kDa. However, the size of this enzyme that was purified in this thesis was found to be approximately 50 kDa as evaluated of gelatine zymography analysis. Further investigation of the proteins in the partially purified enzyme sample by Liquid Chromatography Mass Spectrophotometry, revealed the presence of a metalloprotease enzyme with a predicted mass of 50 kDa. These results showed that the purified and characterised protease enzyme was not the same enzyme of which its gene was amplified gene was amplified and sequenced. Nevertheless, the partial characterization of the extracellular metalloprotease was performed, and the optimum temperature and pH was found to be 30°C and 8.0 respectively. The enzyme showed high activity in the presence of calcium, ethanol. The enzyme showed extremely high stability up to 25°C above this temperature; the stability dropped sharply which confirmed that the protease was a cold active enzyme and can have a potential to be used in cold temperature applications.

Proteazlar proteinleri daha küçük parçalara peptid bağlarını hidroliz ederek yıkan enzimlerdir. Proteazlar hücre içine ve dışına salgılanabilirler, bu deneyde soğuk aktif hücre-dışı proteaz enzimi ile çalışılmıştır. Proteaz enzimi bitki, mantar, hayvan, virus ve bakteri gibi bir çok canlılar tarafından üretilmektedir. Mikrobiyal proteazların endüstriyel kulanımları, diğer organizmalardan üretilen proteazların kullanımından daha yaygındır. Çünkü mikrobiyal proteazların endüstriyel kullanımı, bu enzimlerin gerek kolay üretilmeleri, gerekse kolay izole edilmeleri gibi bir çok sebepten ötürü bitkisel ve hayvansal.proteazlardan.daha.fazladır. Pseudomonas sp. KE-38 bakterisinden izole edilen hücre-dışı proteaz enziminin kısmi sekansı elde edilmiştir. Sekans analizinden sonra bu gen tarafından kodlanan tahmini boyut 105 kDa olarak belirlenmiştir. Ancak bu tezde saflaştırılan bu enzimin boyutu, SDS-PAGE ve jelatin zimografi analizi sonucunda yaklaşık 50 kDa olarak bulunmuştur. Kısmen saflaştırılmış enzim numunesindeki proteinlerin Sıvı Kromatografi Kütle Spektrofotometrisi ile daha detaylı araştırılmıştır. SDS ve Zymography analizine uygun olarak tahmini 50 kDa kütleye sahip bir metaloproteaz enziminin varlığını ortaya çıkarmıştır. Bu sonuçlar, saflaştırılan ve karakterize edilen proteaz enziminin, geni amplifiye edilen ve sekanslanan enzimle aynı olmadığını göstermiştir. Yine de hücre dışı metaloproteazın kısmi karakterizasyonu yapılmıştır ve optimum sıcaklık ve pH'ın sırasıyla 30°C ve 8 olduğu bulunmuştur. Enzim ayrıca kalsiyum ve etanol ve metanol gibi alkollerin varlığında da yüksek aktivite göstermiştir. Enzim, 25°C sıcaklığa kadar son derece yüksek stabilite göstermiştir; bu sıcaklığın üzerinde ise kararlılık keskin bir şekilde düşmüştür ve bu da proteazın soğukta aktif bir enzim olduğunu ve soğuk sıcaklık uygulamalarında kullanılma potansiyeline sahip olabileceğini doğrulamıştır.