Investigation of long non-coding RNA and chromatin interactions in HeLa cells

Abstract

The DNA in the cells is surrounding histone proteins to form nucleosomes. The structure is packed further into chromatin. The chromatin structure is dynamic and flexible. It is regulated by many factors including long non-coding RNAs (lncRNAs). LncRNAs are a class of non-coding RNAs, transcripts that do not encode protein. They are longer than 200 nucleotides and might contain a polyA tail and a 5’ cap. Thus, they are localized in the nucleus. lncRNAs interact with chromatin in two ways, indirect and direct. Direct interaction occurs via two mechanisms: R-loop and triplex formation. These interactions affect the folding of chromatin inducing gene expression under various cellular conditions. LncRNAs interacting with chromatin regulating genes are found in HEK cells. Thus, it is hypothesized that lncRNA – chromatin interactions may differ in cancerous cells as well. In this study, the iMARGI method is optimized to be used in adenocarcinoma HeLa cells. The chromatin digestion and incubation conditions are adjusted to give optimal results for HeLa cells. iMARGI is a recently developed method employed to investigate such interactions in a genome-wide manner. iMARGI allows the isolation of all lncRNAs interacting with the whole genome. The interacting RNA – DNA molecules are pulled down with streptavidin conjugated beads after linker ligation. The chimeric molecules are amplified with PCR forming lncRNA – chromatin libraries of HeLa cells. In the future, new libraries can be formed after inducing apoptosis in HeLa cells. Identification of lncRNAs involved in chromatin remodeling in apoptotic conditions can facilitate new therapeutic methods for fighting tumor initiation and development.

DNA hücre içerisinde histon proteinlerinin etrafına sarılı halde bulunur ve bu yapılar katlanarak nükleozomları oluşturur. Ardından tekrar katlanma gerçekleşerek kromatin yapısı oluşturulur. Bu yapının regülasyonu genlerin okunması için çok önemlidir. Hücrenin durumuna göre katlanmalarda değişiklikler gerçekleşir. Kromatin regülasyonunda uzun kodlamayan RNA’lar (ukmRNA) görev alır. ukmRNA’lar protein kodlama potansiyeli olmayan 200 nükleotitten daha uzun transkriptlerdir. Bu moleküller polyA kuyrukları ve 5’ başlarını içerir. Böylece, çekirdekte yer alırlar. ukRNA’lar kromatinle dolaylı ya da direkt yoldan etkileşir. Bu direkt etkileşimler sırasında R-loop ya da triplex yapıları oluşur. Önceki çalışmalarda HEK hücrelerinde ukmRNA’ların kromatin katlanmasında görev alan DNA’lar ile etkileştiği görülmüştür. Kanser hücrelerinde de bu etkileşimler görülebilir. Bu bağlamda iMARGI metodu kullanarak adenokarsinom HeLa hücrelerinde bütün kromatinle etkileşen tüm ukmRNA’ların belirlenmesi hedeflenmiştir. Bu metot kapsamında birbiriyle etkileşim halinde olan DNA ve RNA’lar biyotin içeren bir linker molekülü tarafından birleştirildi. Yeni oluşturulan kompleks streptavidin – biotin etkileşimi ile elde edilmiştir. Sonuç örneği PCR ile çoğaltılarak HeLa hücrelerinde kromatinle etkileşen RNA’ların kütüphanesi oluşturulabilecektir. Gelecekte apoptoz indüklenmiş hücrelerden kütüphaneler oluşturabilir. Bu kütüphanelerden bulunan ukmRNA’lar tedavi amaçlı kullanılma potansiyeline sahiptir.