Developing a LAMP PCR based diagnostic test for Crimean Congo hemorrhagic fever virus

Abstract

Crimean-Congo hemorrhagic fever infection is one of the most common tickborne viral infections, non-infectious in animals and fatal to humans with a mortality rate around 40%. The high mortality rate and lack of vaccines or drug treatment point to the potential danger of infection. The aim of this thesis was to detect 21 complete S-segment Crimean-Congo hemorrhagic fever virus strains originating in Turkey using Fluorimetric Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) method, which is one of the PCRbased isothermal amplification methods for detecting viral infections. Conserved regions of the 21 strains of the CCHFV observed in Turkey were determined by sequence alignment and LAMP primers for these conserved regions were designed. DNA of CCHFV Ank-2 (GeneBank accession number: MK309333) strain was used and optimum LAMP reaction conditions were determined by changing the temperature, primer amount and MgSO4 concentration. LAMP results were compared with qPCR, which is considered the gold standard. The detection limit for LAMP and qPCR was 2x106 copies/µl. In the study, the CCHFV LAMP primer set-1 gave similar results to the qPCR primer set. The CCHFV LAMP primer set-4 performed better by turning positive 9 minutes earlier than the qPCR primer set. This results indicate LAMP is an alternative method for detecting CCHFV but reveals the necessity of improving the sensitivity of the test.

Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA) enfeksiyonu kene kaynaklı en yaygın viral enfeksiyonlardan biridir. Enfeksiyonun %10-%40 ölüm oranına sahip olması ve onaylanmış kesin bir tedavisinin olmaması, temas yoluyla bulaşması hastalığın tehlike boyutunu göstermektedir. Enfeksiyonun hızlı tespiti için PCR bazlı, bir saatten kısa sürede sonuç verebilen Florometrik Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon (Florometrik-LAMP) yöntemi kullanıldı. Çalışmada, Türkiye'de görülmüş 21 bütün S segment KKKA virüsünün suşunun sekans dizilimi kullanılarak hizalama çalışması yapıldı ve korunaklı bölgelere uygun LAMP primerleri tasarlandı. LAMP yönteminin testi için KKKA virüsünün Ank-2 (GeneBank Accession number: MK309333) suş DNA'sı kullanıldı. LAMP primerleri için, sıcaklık, primer miktarı ve MgSO4 konsantrasyonu değiştirilerek optimum koşullar belirlendi. Sonuçlar, altın standart yöntem olarak kabul edilen qPCR ile karşılaştırıldı. Çalışmada LAMP ve qPCR için saptama limiti 2x106 kopya/μl olarak belirlendi. CCHFV LAMP primer seti-1 qPCR primer seti ile benzer sonuçlar verirken CCHFV LAMP primer seti-4 qPCR primer setinden daha erken sinyal vererek daha iyi performans gösterdi. Sonuçlar LAMP metodunun qPCR yöntemine alternatif olabileceğini desteklemekle birlikte testin hassasiyetinin geliştirilmesi gerekliliğini de ortaya koymuştur.