Characterization of Designed Novel Cytochrome P450 for Industrial Biocatalysis

Abstract

Biocatalysts are increasingly applied in chemical synthesis due to their high level of regioselectivity and enantioselectivity. P450s are important biocatalysts due to their ability to hydroxylate unactivated carbon atoms using molecular oxygen. P450s catalyze monooxygenation reactions by using nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate) (NAD(P)H) as electron donor and electron transfer proteins. P450s can also utilize hydrogen peroxide (H2O2) instead of NAD(P)H and redox partners through a H2O2-shunt pathway. However, P450s are inefficient in oxygenation reactions with H2O2. Thermophilic enzymes demonstrates high stability at different temperatures, pH and organic solvents, so it is expected to increase implementations of enzymes. CYP119 is an acidothermophilic P450 from Sulfolobus acidocaldarius. In our laboratories, directed evolution was used to create improved mutants of CYP119 with higher oxidation activity when using H2O2. T213R/T214I CYP119 was such a variant. The aim of the study is investigations of T213R/T214I CYP119 whether it is a stable and efficient biocatalyst for selective oxidation of hydrocarbons, which does not require expensive cofactors and electron transfer proteins or not. T213R/T214I CYP119 was expressed and isolated under optimized conditions. Peroxidase activity of T213R/T214I CYP119 was tested and compared to wild type (WT) CYP119. Characterization of T213R/T214I CYP119 shows higher peroxidation activity of enzyme for Amplex® Red, guaiacol and ABTS and epoxidation of enzyme for styrene substrates compared to CYP119. T213R/T214I CYP119 have higher affinity for progesterone and lower affinity for lauric acid. Mutations on Thr213 and Thr214 residues the active site will shed light on the design of novel CYP119 mutants in the future.

Biyokatalizörlerin yüksek seviyeli enantiyo ve bölge seçiciliği sayesinde kimyasal sentezinde kullanım alanları artmıştır. P450'ler, moleküler oksijeni kullanarak aktifleştirilmemiş karbon atomlarını hidroksile etme yeteneklerinden dolayı önemli biyokatalizörlerdir. P450'ler electron donorü ve electron transfer proteinleri olarak nikotinamid dinucleotide (fosfat) (NAD(P)H) kullanarak monooksijenasyon reaksiyonlarını katalize etmektedir. P450'ler ayrıca NAD(P)H yerine hidrojen peroksit (H2O2) ve bir H2O2-şant yolu aracılığıyla redoks partnerleri kullanabilmektedir. Bununla birlikte, P450 enzimleri, H2O2 ile oksijenasyon reaksiyonlarında verimsizdir. Termofilik enzimler, farklı pH, yüksek sıcaklık ve organik solüsyonlara karşı yüksek stabilite göstermektedir. Bu sebeple geniş bir kullanım alanı olması beklenmektedir. CYP119 Sulfolobus acidocaldarius'dan elde edilen asidotermofilik P450'dir. Laboratuvarımızda yönlendirilmiş evrim ile H2O2 eşliğinde yüksek oksidasyon aktivitesi gösteren CYP119 mutantlarının tespiti için mutant kütüphaneleri oluşturulmuştur. T213R/T214I CYP119'u bu kütüphaneden elde edilen en yüksek aktivite gösteren mutanttır. Bu çalışmanın amacı, T213R/T214I CYP119'un pahalı kofaktörler ve elektron transfer proteinleri gerektirmeyen hidrokarbonların seçici oksidasyonu için kararlı ve verimli bir biyokatalizör olup olmadığının araştırılmasıdır. Ayrıca yüksek oksijenleme aktivitesine sahip olan bu mutantın farklı substrat ile etkileşimleri , peroksidasyon, epoksidasyon reaksiyonları ve sıcaklık ve aktivite ilişkisi ve organik solventlere karşı duyarlılılığı gibi birçok açıdan karakterize edilmesi ve WT CYP119 ile karşılaştırılarak farklı yönlerinin açığa çıkarılması hedeflenmektedir. T213R/T214I CYP119'un karakterizasyonu, CYP119'a kıyasla Amplex® Red, guaiacol ve ABTS ve stiren için enzimin daha yüksek peroksidasyon ve epoksidayon göstermektedir. T213R/T214I CYP119, progesteron için daha yüksek afiniteye ve laurik asit için daha düşük afiniteye sahiptir. Enzimin aktif bölgesindeki Thr213 ve Thr214 kalıntılarındaki mutasyonlar, gelecekte yeni CYP119 mutantlarının tasarımına ışık tutacaktır.