Rational design of hemoproteins for peroxidation reactions

Abstract

Biocatalysts are important for the synthesis of fine chemicals and steroidal drugs in the biopharmaceutical industry. Cytochromes P450 (P450) monooxygenases are significant biocatalysts due to their high selectivity for oxidation reactions. CYP119 is the first characterized thermoacidophilic P450. CYP119 was isolated from Sulfolobus acidocaldirius. CYP119 enzyme shows high stability at low pH and high temperature. CYP119 can utilize the peroxidase shunt pathway in the catalytic cycle of P450. These abilities make CYP119 attractive biocatalyst for production of fine chemicals and drugs. In this study, Leu69Gly mutant CYP119 enzyme was cloned by site-directed mutagenesis. L69G and WT CYP119 was expressed successfully in Escherichia coli BL21 (DE3) cells with isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside (IPTG). This study shows that L69G mutation is important for binding to progesterone. This was predicted by in silico mutagenesis in a previous computational study. Isolation and purification of the WT and L69G CYP119 were carried out. Activity assays and substrate binding studies of the enzymes were performed and compared each other. L69G mutation did not cause significant effect on Amplex Red® oxidation and styrene epoxidation activities. L69G CYP119 (KS: 34.55 ± 7.4 μM) showed higher affinity for progesterone compared to WT CYP119 (KS: 69.8 ± 48.9 mM). A new product, thought to be hydroxylated progesterone, was formed as result of hydroxylation of progesterone by L69G CYP119 using peroxidase shunt pathway.

Biyokatalizörler biyofarmasötik endüstrisinde pahalı kimyasalların ve steroid yapılı ilaçların sentezi için önemlidirler. Sitokrom P450 monoksijenazlar, oksidasyon reaksiyonlardaki yüksek seçiciliklerinden dolayı önemli biyokatalizörlerdir. CYP119 ilk karakterize termoasidofilik P450' dir. CYP119 Sulfolobus acidocaldirius' dan izole edilmiştir. CYP119 enzimi düşük pH ve yüksek sıcaklıklarda yüksek kararlılığa göstermektedir. CYP119 P450' lerin katalitik döngüsündeki peroksidaz şant yolağını kullanabilmektedir. Bu yetenekleri CYP119' u pahalı kimyasalların ve ilaçların üretiminde çekici bir katalizör yapmaktadır. Bu çalışmada, Leu69Gly mutant CYP119 enzimi bölgeye yönlendirilmiş mutajenez ile klonlanmıştır. L69G ve WT CYP119, izopropil β-D-l-tiyogalaktopiranosid (İPTG) ile Escherichia coli BL21 (DE3) hücrelerinde başarılı bir şekilde ekspres edilmiştir. Bu çalışmalar sonucunda L69G mutasyonunun progesteron bağlanması için önemli olduğu gözlenmiştir. Daha önceki çalışmada bilgisayar ortamında gerçekleştirilen simülasyonlar ile bu mutasyonun progesterone bağlanmasını arttıracağı tahmin edilmiştir. L69G ve WT CYP119 enzimlerinin izolasyonu ve saflaştırması gerçekleştirilmiştir. L69G ve WT CYP119 enzimlerinin aktivite analizleri ve substrata bağlanma çalışmaları yürütülmüştür ve birbiriyle karşılaştırılmıştır. L69G mutasyonu Amplex Red® oksidayonunda ve stiren epoksidayonunda önemli bir etkiye neden olmamıştır. L69G CYP119 (KS: 34.55 ± 7.4 μM), WT CYP119 (KS: 69.8 ± 48.9 mM) ile karşılaştırıldığında progesterona daha yüksek affinite göstermiştir. Peroksidaz şant yolağı kullanarak L69G CYP119 ile progesteron hidroksilasyonu gerçekleştirildiğinde yeni bir ürün tespit edilmiştir. Bu ürünün hidroksillenmiş progesteron olduğu düşünülmektedir.