Bioinformatics based approach to design a thermophilic P450 fot industrial biocatalysis

Abstract

Enzyme catalyzed biosynthesis of steroidal drugs is an important process for pharmaceutical manufacturing. Cytochrome P450 (P450) monooxygenases are important for hydroxylation of steroid structures because they can catalyze the oxidation of inactive carbon bonds with high selectivity and efficiency. CYP119 is an acidothermophilic P450 from Sulfolobus acidocaldarius, which has the potential to be used as biocatalyst for industrial production since it shows activity at high temperature and low pH conditions. In this work we aim to use CYP119 for selective hydroxylation of progesterone, which is not the original substrate of CYP119, for production of precursor molecules of important hormones like cortisone and aldosterone. Crystal structure of CYP119 (PDB ID: 1F4T) was used for selecting residues that were mutated according to structural alignment with other CYPs that can catalyze progesterone hydroxylation naturally. Progesterone-docking performed with CYP119 to identify residues that create clashes with substrate. Finally selected 12 residues (Leu69, Val151, Phe153, Leu155, Leu205, Ile208, Ala209, Thr213, Thr214, Val254, Thr257, Leu354) were mutated with PyRosetta program to Gly, Glu, Phe, Met, Ala, His, Arg and Ile. Progesterone-docking performed with using DockMCM Protocol of PyRosetta. We used two different starting coordinates of progesterone for docking and results were eliminated according to their energy scores. Best mutants were used for creating double/triple mutants and second round of docking and elimination process were performed with using double/triple mutant enzymes. Final number of 11 mutants with best scores were selected and their possible products were identified.

Steroid temelli ilaçların enzim katalizli biyosentezi farmasötik üretimi için önemli bir süreçtir. Sitokrom P450 (P450) monooksijenazlar inaktif karbon bağlarının oksidasyonunu yüksek seçicilik ve etkinlikle katalizleyebildikleri için steroid yapıların hidroksilasyonu açısından önemlilerdir. Asidoterfomilik bir arkea olan Sulfolobus acidocalderius’tan elde edilen CYP119, yüksek sıcaklık ve düşük pH koşullarında aktivite gösterdiği için endüstriyel üretimde biyokatalist olarak kullanılma potansiyeline sahiptir. Bu çalışmada CYP119 kullanılarak orijinal substratı olmayan progesteron hormonunun seçici hidroksilasyonuyla, aldosteron ve kortizon gibi önemli hormonların öncül moleküllerinin üretimi amaçlanmıştır. Doğal olarak progesteron hidroksilasyonunu katalizleyen CYPlerle yapılacak yapısal hizalanma sonucu mutasyona uğratılacak aminoasitlerin belirlenmesi için CYP119’un kristal yapısı (PDB NO: 1F4T) kullanılmıştır. Substratla çakışma veren amino asitleri belirlemek için CYP119 enzimine progesteron yerleştirme yapılmıştır. Finalde seçilen 12 amino asit (Leu69, Val151, Phe153, Leu155, Leu205, Ile208, Ala209, Thr213, Thr214, Val254, Thr257, Leu354), PyRosetta program kullanılarak Gly, Glu, Phe, Met, Ala, His, Arg ve Ile amino asitleriyle mutasyona uğratılmıştır. Progesteron yerleştirme için PyRosetta programının DockMCM protokolü uygulanmıştır. Yerleştirme için iki farklı progesteron başlangıç koordinatı kullanılmış ve sonuçlar enerji değerlerine göre elenmiştir. En iyi mutantlar ikili/üçlü mutasyonları oluşturmak için kullanılmış ve yerleştirme ve eleme işleminin ikinci etabı ikili/üçlü mutantlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Finalde en iyi sonuç veren 11 mutant seçilmiş ve olası ürünleri belirlenmiştir.