Directed evolution of a cytochrome P450 enzyme to increase peroxidation activity

Abstract

Directed evolution, mimicking the natural selection, is a powerful tool to create novel enzymes. Evolution of natural enzymes to achieve desired properties are performed in iterative rounds of random mutagenesis followed by a screening/selection method. Enzyme activity can be enhanced with substituting the active site amino acids in the enzyme. CYP119, a member of cytochrome P450 protein family, is a thermophilic enzyme extracted from Sulfolobus acidocaldarius that exhibits monooxygenase, peroxidase and oxidoreductase activity. These properties give CYP119 a potential to be used in production of fine chemicals and pharmaceuticals. Herein, two different mutant libraries of CYP119, containing substituted amino acids at Thr213-Thr214 and Val151- Phe153 positions, constructed via combinatorial active site saturation test (CAST), and screened for improved peroxidation activity. Additionally, fluorescence based Amplex Red peroxidation activity assay using hydrogen peroxide as cofactor of CYP119 was optimized. Screening of mutant libraries resulted four improved CYP119 mutant enzymes from Thr213-Thr214 mutant library. Val151-Phe153 mutant library did not yield any improved peroxidation activity mutants which indicated amino acid substitutions at 151- 153 positions do not have any effect on peroxidation activity of CYP119. Furthermore, effect of substituted amino acids at predetermined positions were analyzed. Substrate, Amplex Red, makes single or double hydrogen bond when molecular docking was performed on improved mutant enzymes also distance of nitrogen atom in Amplex Red to heme iron is closer than wild type CYP119 in improved mutant enzymes. Thus, increasing the peroxidation activity of mutant CYP119 enzymes.

Yönlendirilmiş evrim, doğal seçilimden esinlenilmiş ve yeni enzimler tasarlamak için kullanılan etkili bir yöntemdir. Doğada bulunan enzimlere, istenilen özellikleri eklemek ya da geliştirmek için, ötelemeli rastgele mutasyon ve devamında tarama/seçme metodu uygulanır. Enzim aktiviteleri, enzimin aktif kısmında bulunan amino asitlerin değiştirilmesi ile yükseltilebilir. Sitokrom P450 protein ailesinin üyesi olan CYP119, Sulfolobus acidocaldarius’tan izole edilmiştir ve termofilik bir enzimdir. Buna ek olarak CYP119 enzimi monooksijenaz, peroksidaz ve oksidoredüktaz aktivitesi göstermektedir. Bu özellikleri ile CYP119 enzimi saf kimyasalların ve farmasötiklerin üretiminde kullanılmak üzere potansiyel taşımaktadır. Bu çalışmada, Thr213.-Thr214 ve Val151- Phe153 pozisyonlarında değişiklik yapılmış iki farklı CYP119 mutant kütüphanesi artırılmış peroksidaz aktivitesi için taranmıştır. Buna ek olarak, hidrojen peroksiti CYP119’un kofaktörü olarak kullanan, floresan tabanlı Amplex Red testi optimize edilmiştir. Mutant kütüphanelerinin taranması, Thr213-Thr214 mutant kütüphanesinden dört adet peroksidasyon aktivitesi geliştirilmiş mutanın açığa çıkarılmasını sağlamıştır. Val151-Phe153 kütüphanesinden peroksidasyon aktivitesi geliştirilmiş mutant bulunamamıştır ve 151-153 pozisyonlarındanki amino asit değişikliklerinin aktiviteye herhangi bir etkisi olmadığı gözlemlenmiştir. Ek olarak, önceden belirlenmiş pozisyonlardaki amino asitlerin değiştirilmesinin etkileri de incelenmiştir. Moleküler doking uygulandığında, Amplex Red substratı, özellikle geliştirilmiş mutant enzimler ile tekli veya ikili hidrojen bağı yapmaktadır. Bununla birlikte, geliştirilmiş mutant enzimlerde, Amplex Red’de bulunan azot atomunun heme grubunda bulunan demir atomuna, yabanıl tipe göre, daha yakın olduğu gözlemlenmiştir. Böylece, seçilen mutant CYP119 enzimler geliştirilmiş peroksidasyon aktivitesine sahip olmuştur.