Cloning and Purification of Biosynthetic Enzymes

Abstract

Bioproducts have become prominent with their sustainable, eco-friendly and renewable features. In recent years, research and development studies focused on production of biodiesel and pharmaceuticals. Biodiesel can be synthesized in the form of fatty acid ethyl ester (FAEE) by in vivo activity. This synthesis is catalyzed by wax ester synthases (WS). This study aims cloning and purification of wax ester synthases from Psychrobacter arcticus 273-4 (PaWES) and Mus musculus C57BL/6 (MmWES). PaWES was cloned and expressed by Escherichia coli BL21(DE3) strain, at the proper conditions with using pET expression system. It was purified with approximately 1 mg yield. Cloning of the second wax ester synthase (MmWES) was achieved to Saccha-romyces cerevisiae and it was purified with lower than 1 mg yield. The other aim of this study is related to taxadien-5α-ol-O-acetyltransferase from Taxus cuspidata (TcT5AT). This enzyme belongs to the biosynthesis pathway of Taxol, which is the most commonly used chemotherapy drug. Cloning and purification studies of this enzyme were successfully performed. It was expressed by Escherichia coli BL21(DE3) Star strain and purified with the yield of 23 mg. Immobilized Metal Affinity Chromatog-raphy (IMAC) is used for all three enzymes as a purification strategy. This project can pave the way for structural studies of all biosynthetic enzymes mentioned above. In summary, the findings of this study will circuitously help for solving the relationship between function and structure of these enzymes. It may lead to increased generation of Taxol and FAEE based biodiesel.

Biyoürünler, petrol kaynaklı ürünlere göre sahip oldukları avantajlarla ve yenilenebilir kaynaklara dayalı, çevre dostu bir üretime sahip olmalarıyla her geçen gün daha da önem kazanmaktadırlar. Biyoürün sınıflarına baktığımızda, araştırma ve geliş-tirme çalışmalarının en yoğun olduğu alanlar ilaç ve biyoyakıt üretimidir. Biyoyakıt olarak en büyük potansiyele sahip olan biyodizel, mikroorganizmalar kullanılarak da üretilebilmektedir. Bu sentezdeki kilit role sahip olan mum esteri sentaz enzimlerinin, önceki çalışmalarda farklı organizmalardan izole edildiği belirtilmiştir. Bu çalışmada, Psychrobacter arcticus 273-4 (bakteri) ve Mus musculus C57BL/6 (fare) kaynaklı iki mum esteri sentaz enziminin klonlanması ve saflaştırılması amaçlanmıştır. P. arcticus 273-4 kaynaklı mum esteri sentaz enzimi pET22bTV vektörüne klonlanmış, Escherichia coli bakterisinin BL21(DE3) hücre hattı kullanılarak üretilmiş ve yaklaşık 1 mg verimle saflaştırılmıştır. Mus musculus C57BL/6 (fare) kaynaklı diğer mum esteri sentaz enzimi de Saccharomyces cerevisiae maya türüne klonlanmış ve 1 mg'dan daha düşük bir verimle saflaştırılmıştır. Çalışılan son enzim Taxus cuspidata kaynaklı taxadien-5α-ol-O-asetil-transferaz, en yaygın kullanılan kemoterapi ilacı Taxol'ün biyo-sentezinde önemli bir role sahiptir. Bu enzim, gen ifade vektörü olan pET22bTV sis-temine klonlanmıştır. Daha sonra enzimin üretimi, Escherichia coli bakterisi ile BL21 (DE3) Star hücre hattı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Saflaştırma işlemleri sonucunda yaklaşık 23 mg protein elde edilmiştir. Temel yaklaşım olarak, üç enzimin de saflaş-tırma çalışmaları immobilize metal afinite kromatografi metodu ile gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma; gelecek vaat eden ürünlerin biyosentezinde görev alan üç önemli enzimin klonlanması ve saflaştırılması koşullarını açığa çıkararak, gelecekteki yapısal protein mühendisliği çalışmalarına dolaylı olarak yardımcı olmuştur.