The investigation of anticancer properties of (R)-4'-methylklavuzon in liver cancer cells and liver cancer stem cells

Abstract

Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fifth most seen cancer type and the third leading cause of death from cancers. HCC is a fatal disease and HCC patients have a 5-year survival rate of 14%. Discovery and identification of mechanisms of action for new therapeutic agents are required for a better treatment of HCC. One of the most important target in cancer treatment is the epigenetic acetylation of histones. Histone deacetylases (HDAC) and sirtuins provide chromatin compaction and transcriptional repression by removing acetyl groups from histone proteins and nonhistone proteins. Re-acetylation of chromatin and re-expression of tumor suppressor genes with the discovery of novel HDAC and/or sirtuin inhibitors are therapeutic targets in cancer research. In this study, (R)-4’-methylklavuzon was found to be cytotoxic in HuH-7 cells with IC50 values of 1.25 μM for HuH-7 parental cells, 2.5 μM for EpCAM+/CD133+ HuH-7 cells and 1.25 μM for EpCAM-/CD133- HuH-7 cells. It was observed that (R)-4’-methylklavuzon causes cell cycle arrest at G1 phase at 1.00 μM concentration in three cell populations, it induces apoptosis at 10 μM concentration at the end of 24 hours incubation. (R)-4’-methylklavuzon does not inhibit Class I/II HDACs in vitro whereas it causes inhibition of endogenous HDACs and/or sirtuins inside the cells sorted by MACS and FACS at 0.10 μM concentration. (R)-4’-methylklavuzon upregulates p21 expression significantly in HuH-7 cell populations to cause G1 arrest. It causes 45% inhibition in p53/MDM2 complex formation when examined with pure p53 and MDM2 proteins. Drug candidate causes 46% SIRT1 inhibition at 100 μM concentration in vitro whereas there was no inhibition of HDAC1 enzyme at the same concentration. SIRT1 protein levels in HuH-7 parental cells were upregulated to 240% within 24 hours of incubation with 3.00 μM of drug candidate. It was found that (R)-4’-methylklavuzon can also inhibit CRM1 protein providing increased retention of tumor suppressor proteins in the nucleus. p53 was overexpressed at 0.10 and 1.00 μM concentrations within 6 and 24 hours in HepG2 cells but slightly overexpressed in HuH-7 parental cells.

Hepatoselüler karsinoma (HSK) beşinci en yayın kanser türü olup kanser nedeniyle ölümlerin üçüncü en yüksek nedenidir. HSK ölümcül bir hastalık olup HSK hastalarının 5 yıllık yaşam süreleri %14’tür. Yeni terapötik ajanların keşfi HSK tedavisi için gerekmektedir. Kanser tedavisinde en önemli hedeflerden birisi histonların asetilasyonudur. Histon deasetilazlar (HDAS) ve sirtuinler asetil gruplarını histon proteinlerinden uzaklaştırarak kromatin sıkılaşmasına ve transkripsiyonel represyona sebep olurlar. Yeni HDAS/sirtuin inhibitörleri ile kromatinin tekrar asetillenerek tümör baskılayıcı genlerin tekrar eksprese edilmesi terapötik hedeflerdendir. Bu çalışmada, (R)-4’-metilklavuzon’un HuH-7 parental hücreleri için 1.25 μM, EpCAM+/CD133+ HuH-7 hücreleri için 2,5 μM; EpCAM-/CD133- HuH-7 hücreleri için 1.25 μM olan IC50 değerleri ile sitotoksik olduğu bulunmuştur. (R)-4’- metilklavuzon’un üç hücre populasyonunda 1,00 μM konsantrasyonda G1 fazında hücre döngüsünde birikmeye sebep olduğu ve 24 saatlik inkübasyonda 10 μM konsantrasyonda apoptozu indüklediği gözlemlenmiştir. (R)-4’-metilklavuzon’un in vitro koşullarda sınıf I/II histon deasetilaz enzimlerini inhibe etmediği ancak MACS ve FACS ile ayrımlanmış hücrelerdeki endojen sınıf I/II histon deasetilazları ve/veya sirtuinleri 0,10 μM konsantrasyonda hücre içinde inhibe ettiği bulunmuştur. (R)-4’- metilklavuzon, HuH-7 hücrelerinde p21 ekspresyonunu 3,3 kata kadar arttırabilmiştir. p53/MDM2 kompleks oluşumunu %45 oranında azalttığı görülmüştür. In vitro koşullarda SIRT1 enziminin 100 μM ilaç adayı ile %46 oranında inhibe olduğu bulunmuştur. HuH-7 hücrelerindeki SIRT1 protein seviyelerinin 3,00 μM ilaç adayı ile 24 saatlik inkübasyonunda %240 oranında artmıştır. (R)-4’-metilklavuzon’un CRM1 proteinini inhibe ederek tümör baskılayıcı proteinleri nukleus içinde tutabileceği anlaşılmıştır. 0,10 μM ve 1,00 μM ilaç adayı ile 6 ve 24 saat muamele edilen hücrelerdeki p53 protein seviyelerinin HepG2 hücrelerinde yüksek miktarda artış gösterdiği ancak HuH-7 hücrelerinde çok az bir artış gösterdiği bulunmuştur.