Investigation of the effects of the HIV-1 Tat gene on the expression of secretory leucocyte protease inhibitor in primate cell lines

Abstract

Old world monkey species including African green monkey (AGM) are resistant to HIV-1. Although the virus can gain entry into the susceptible cells of these monkeys, virus replication is blocked prior to viral genome integration by the restriction factors. HIV-1 Tat are the first viral protein that are produced after viral genome integration and they are essential for the production of other viral proteins. According to our preliminary results, AGM CV-1 cells that are known to be resistant to HIV-1 were transfected with HIV-1 regulatory tat. Then, protein profiles of Tat and empty vector expressing AGM CV-1 were compared by 2D-PAGE and that way observed to be induced in cells expressivity tat was identified to be SLPI by mass spectrometry analysis. Based on our literature reviews, SLPI is found to be an anti-bacterial, anti-fungal and anti-inflammatory protein. SLPI also has an extracellular anti-HIV-1 effect. Our study aims to measure SLPI expression level in AGM and human cells in presence of HIV-1 tat and to research effect of SLPI on NF-kB and HIV LTR promoter. In our research, expression level of SLPI gene is measured by QRT-PCR method. SLPI protein was screened by Western Blot method. SLPI’s effect on NF-kB and HIV-LTR promoter was researched through the luciferase experiment. While SLPI gene shows increase in AGM cells in presence of HIV-1 tat, no such increase was observed in human cells. Furthermore, it has been shown that SLPI gene decreases luciferase expression dependent on NF-kB promoter and HIV-LTR. In other words, SLPI suppresses NF-kB promoter and HIV-LTR.

Afrika Yeşil Maymunu (AYM)’nun da içinde bulunduğu eski dünya maymunu türleri HIV-1’e karşı dirençlidirler. HIV-1 virüsü, bu maymunların hücrelerine girebilmesine rağmen hücre içinde viral genomun entegrasyonundan önceki aşamalarda bloke olmaktadır. HIV-1 Tat ve Rev proteinleri, HIV-1 viral genomunun hücreye entegrasyondan sonra üretilen ilk viral proteinlerdir ve diğer viral proteinlerin üretilmesi için mutlaka gereklidir. Yaptığımız ön çalışmada, HIV-1 enfeksiyonuna karşı dirençli olduğu bilinen AYM CV-1 hücre hatlarına HIV-1 gen ekspresyonunu yönlendiren tat ve rev genlerini aktardık. Daha sonra, HIV-1 Tat ve Rev proteinlerini üreten ve sadece boş vektör içeren AYM CV-1 hücre hatlarından elde ettiğimiz proteinlerin profillerini karşılaştırdık. Protein spotlarından birinin analizi sonucunda, HIV-1 Tat ve Rev proteinlerini eksprese eden hücre hattında SLPI (sekretör lökosit proteaz inhibitörü) protein ekspresyonunda artış tespit ettik. Literatür taramalarımız sonucunda, SLPI’nın antibakteriyel, anti-fungal ve anti-inflamatuar etkilerinin yanı sıra hücre dışı anti -HIV-1 etkisinin (virüsün hücre içerisine girmeden etkisiz hale getirilmesi durumu) de olduğunu saptadık. Çalışmamızda HIV-1 tat varlığında AGM ve insan hücrelerindeki SLPI ekspresyon seviyesinin ölçülmesi, SLPI’nin NF-kB ve HIV LTR promoter üzerine etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Araştırmamızda SLPI geninin ekpresyon seviyesi QRT-PCR yöntemi ile ölçülmüştür. SLPI proteini Western Blot yöntemi ile görüntülenmiştir. Lusiferaz deneyi ile SLPI’nin NF-kB ve HIV-LTR promotörü üzerine etkisi araştırılmıştır. SLPI geninin HIV-1 tat varlığında AGM hücrelerinden artış gösteririken, insan hücrelelerinde böyle bir artış gözlenmemiştir. Ayrıca SLPI geninin NF-kB promotörüne ve HIV-LTR bağlı lusiferaz ekspresyonu azalttığı gösterilmiştir. Diğer bir ifadeyle SLPI nin NF-kB promotörünü ve HIV-LTR’ ı baskılamaktadır.