Sisplatin uygulanmış hela hücrelerinde m6A RNA modifikasyonlarının belirlenmesi ve fonksiyonel karakterizasyonu

Abstract

N6-metiladenozin (m⁶A), RNA üzerinde en fazla bulunan ve dinamik bir modifikasyondur. Bu çalışmada m⁶A modifikasyonun HeLa hücrelerinin sisplatin (CP) uygulamasına verdiği yatının düzenlenmesindeki fonksiyonu araştırılmıştır. İlk olarak, CP uygulanmış HeLa hücrelerinde temel m⁶A düzenleyicilerinin seviyeleri ve ardından m⁶A metilasyon dağılımı tüm transkriptom çapında incelendi. Analiz sonucunda, m⁶A yazıcılarının, özellikle METTL4'ün ekspresyonun değişikliğinin olası etkisi olarak, m⁶A metilasyon profilinde anlamlı farklar belirlendi. Özellikle, CP uygulamasını takriben global metilasyon seviyesindeki düşüş aynı uygulama sonucunda gözlemlenen METTL14'ün protein seviyesindeki önemli azalma ile ilişkilendirilebilir. METTL14 susturması sonucunda hücrelerin, özellikle transfeksiyonun 72. ve 96. saatlerinde CP'ye daha hassasiyet gösterdiği tespit edildi. Bu hassasiyet hücre ölümü ile ilgili genlerin RNA sevilerinde METTL14 susturulması sonucunda gözlemlenen artıştan kaynaklanıyor olabilir. Bununla birlikte, aday genler arasından, ATF3, ATF5, DUSP6 ve PEA15 gibi genler tutarlı ifade modelleri sergilerken, TP73, BMF, DAPK1 ve DAB2IP, CP RNA-seq verilerinde tanımlanan yönlere zıt mRNA seviyeleri sergiledi. Bu bulgular, METTL14'e bağlı gerçekleşen metilasyonun, bu genlerin mRNA düzenlenmesinde, dolasıyla CP etkisini artırmasında çok önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Ayrıca, YTHDF2'nin pro-apoptotik adaylara koşula özgün olarak kontrol hücrelerinde daha fazla bağlanma yatkınlığı gösterdiği belirlenmiştir. Bu durum bu genlerin normal koşullarda YTHDF2 tarafından indüklenen RNA bozulması ile seviyelerinin kontrol edildiğini ancak CP uygulaması ile bağlanma etkinliğinin azalması nedeni ile aynı genlerin sabitliğinin arttığını işaret etmektedir. Bu çalışma, CP yanıtı ile dinamik m⁶A modifikasyonu arasındaki karşılıklı etkileşimi göstermektedir. Özellikle METTL14'ün sisplatin etkinliğini m⁶A metilasyonu ekseninde artırdığının altını çizerek, kanser tedavisinde m⁶A dağılımını düzenleyen yolakları hedef alan terapötik stratejilere yönelik araştırmalar için temel sağlayabilir.

N6-methyladenosine (m⁶A) modification is the most abundant and dynamic RNA modification that critically influences transcript fate post-transcriptionally. This study investigated the role of m⁶A RNA modification in regulating the response to cisplatin (CP) treatment in HeLa cells. The status of core m⁶A modulators following CP exposure was examined, followed by a transcriptome-wide analysis of m⁶A methylation. The findings revealed significant alterations in the m⁶A RNA methylation landscape by possible effects of changes in the expression of key m⁶A writer proteins, particularly METTL14. METTL14 depletion increased CP sensitivity, significantly elevating RNA levels of cell-death-related genes at the 72nd and 96th hrs after siRNA transfection. Genes such as ATF3, ATF5, DUSP6, and PEA15 displayed consistent expression patterns, while TP73, BMF, DAPK1, and DAB2IP exhibited opposite mRNA levels compared to those identified in CP RNA-seq data. These findings suggest that METTL14-directed methylation plays a crucial role in the mRNA regulation of these genes. Furthermore, YTHDF2 was found to regulate mRNA abundance of candidates through mRNA decay, with enriched binding to pro-apoptotic genes (TP73, DAPK1, ATF3, BMF, GADD34, ATF3, DUSP6) in control cells rather than CP-treated cells. This indicates that these genes might be subject to YTHDF2-mediated post-transcriptional regulation. This study highlights the dynamic nature of m⁶A modification in response to CP treatment. It underscores the significant role of METTL14 in modulating transcript fate, providing a foundation for future research into therapeutic strategies targeting m⁶A regulatory pathways in cancer treatment.