Development of a plasmonic biosensor for detection of exosomes

Abstract

The aim of this work was to develop Localized Surface Plasmon Resonance (LSPR) surfaces for quantitative detection of exosomes from different sources. For this aim, gold nanorods (AuNRs) with a mean diameter of 40 nm with an aspect ratio of 2.9 were first synthesized and characterized. The self-assembly of AuNRs on glass wafers were optimized through several experiments. In parallel, PEGylation of cetrimonium bromide (CTAB) stabilized AuNRs was investigated using PEGs with three different molecular weights via LSPR, zeta potential and XPS techniques. PEGylated AuNRs were further self-assembled on silanized microscope slides as confirmed. Surface functionalization of AuNR patterned slides was performed using alkane thiol molecules having carboxylic acid and hydroxyl functional groups and confirmed via XPS, FTIR and zeta potential. Specific antibodies (Ab) were conjugated to the surface following two different methods, i.e. click and NHS/EDC chemistry. To perform click chemistry strategy, ImmuneLink® molecules were conjugated with Abs and the final conjugate was used to functionalize surfaces prepared beforehand using azide bearing molecules. The functionalization procedure was confirmed via XPS FTIR and LSPR spectroscopy. The orientation of the antibodies on the AuNRs patterned surfaces was investigated with LSPR in comparison with conventional EDC/NHS chemistry. The click-chemistry strategy proved to provide conjugation of antibodies through their Fc regions exposing Fab regions better for antigen recognition. Finally, surfaces functionalized with a variety of antibodies were used to detect first a pregnancy-associated protein, PLAP, and then exosomes obtained from human semen samples with pre-determined exosome concentrations. The LoD of the biosensor surfaces was found to be between 103-104 exosomes/mL and 5 ng/mL (0.3 pM) PLAP. Human breast cancer cell culture samples having an unknown concentration of exosomes were further analyzed using the newly developed LSPR biochips and the exosome concentration was determined as 108 exosomes/mL for MCF-7 cell line and 107 exosomes/mL for MDA-MB-231 cell line.

Bu çalışmanın amacı, farklı kaynaklardan eksozom tespiti için lokalize yüzey plazmon rezonans (LSPR) yüzeyleri geliştirmektir. Bu amaçla, ortalama 40 nm çapında 2.9'luk en-boy oranına sahip altın nanoçubuklar sentezlenmiş ve karakterizasyonları tamamlanmıştır. Ardından, altın nanoçubukların cam yüzeyler üzerinde kendiliğinden organizasyonları çeşitli deneyler ile optimize edilmiştir. Paralelinde, CTAB stabilize altın nanoçubukların üç farklı molekül ağırlığındaki PEGler ile PEGilasyonu ayrıntılı olarak incelenmiş ve altın nanoçubukların PEGilasyonu için optimum koşullar LSPR, yüzey yükü testi ve XPS kullanılarak belirlenmiştir. PEGilasyona uğramış altın nanoçubukların silanlanmış mikroskop lamları üzerinde kendiliğinden organizasyonu sağlanmış ve sonuçlar LSPR, XPS ve yüzey yükü testi ile onaylanmıştır. Altın nanoçubukların yüzey fonksiyonelleştirmesi, fonksiyonel karboksilik asit ve hidroksi gruplarını içeren aynı zamanda tiyol bağlı küçük alkan tiyol molekülleri kullanılarak elde edilmiştir ve bu, XPS, FTIR ve yüzey yükü testi ile doğrulanmıştır. İlgili spesifik antibodiler EDC/NHS kimyası ve klik kimyası kullanılarak yüzeylere bağlanmıştır. Klik kimyası için, ImmuneLink ® molekülü spesifik antibodiler ile konjuge edilmiş ve bu konjugatlar önceden azid ile fonksiyonelleştirilmiş yüzeylere bağlanmıştır. Bu fonksiyonelleştirme XPS, LSPR ve FTIR ile gösterilmiştir. Altın nanoçubuk desenine sahip yüzeyler üzerindeki antibodilerin oryantasyonu, EDC/NHS kimyası ile fonksiyonelleştirilmiş yüzeylerle karşılaştırılarak LSPR ile kontrol edilmiştir. Klik kimyası ile hazırlanmış yüzeylerde antibodilerin Fc bölgelerinden bağlanma sağlayarak antijen tanımaya yönelik Fab bölgelerini açıkta bırakacak şekilde oryantasyon sağladığı kanıtlanmıştır. Son olarak yüzeyler farklı antibodiler ile modifiye edilerek, hamilelik sırasında ortaya çıkan protein, PLAP, ve konsantrasyonu önceden belirlenmiş olan insan sperm eksozomları ile kullanılmıştır. Yüzeylerin eksozom tanıma limiti 103 -104 eksozom/mL ve 5 ng/mL (58 pM) PLAP protein cevabı olarak bulunmuştur. Hazırlanan LSPR biyoçipler, bilinmeyen eksozom konsantrasyonundaki insan meme kanseri hücre hatları kullanılarak test edilmiş ve eksozom konsantrasyonları MCF-7 hücre hattı için 108 eksozom/mL ve MDA-MB-231 hücre hattı için 107 eksozom/mL olarak bulunmuştur.